Mit neuer Mikroskopietechnik das Innere lebender Zellen detaillierter sehen

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Upgrade zur quantitativen Phasenbildgebung kann Bildklarheit durch Erweiterung des Dynamikbereichs erhöhen.
Experten für optische Physik haben einen neuen Weg entwickelt, um das Innere lebender Zellen mit bestehender Mikroskopietechnik detaillierter zu sehen, ohne Farbstoffe oder Fluoreszenzfarbstoffe hinzufügen zu müssen.
Da einzelne Zellen nahezu lichtdurchlässig sind, müssen Mikroskopkameras extrem feine Unterschiede im Licht erkennen, das durch Teile der Zelle fällt.

Diese Unterschiede werden als Phase des Lichts bezeichnet.

Die Bildsensoren der Kameras sind durch die Menge der Lichtphasenunterschiede, die sie erkennen können, begrenzt, was als Dynamikbereich bezeichnet wird.

“Um mit demselben Bildsensor mehr Details zu sehen, müssen wir den dynamischen Bereich erweitern, damit wir kleinere Phasenänderungen des Lichts erkennen können”, sagt Associate Professor Takuro Ideguchi vom University of Tokyo Institute for Photon Science and Technology.
Das Forscherteam entwickelte eine Technik, bei der zwei Aufnahmen gemacht werden, um große und kleine Änderungen der Lichtphase getrennt zu messen und sie dann nahtlos zu einem hochdetaillierten Endbild zusammenzufügen.

Sie nannten ihre Methode Adaptive Dynamic Range Shift Quantitative Phase Imaging (ADRIFT-QPI) und veröffentlichten ihre Ergebnisse kürzlich in Light: Science & Applications.

“Unsere ADRIFT-QPI-Methode benötigt keinen speziellen Laser, kein spezielles Mikroskop oder Bildsensoren; wir können lebende Zellen verwenden, wir brauchen keine Färbungen oder Fluoreszenz, und es gibt nur ein sehr geringes Risiko für Phototoxizität”, sagt Ideguchi.
Phototoxizität bezieht sich auf das Abtöten von Zellen durch Licht, was bei einigen anderen Bildgebungsverfahren, wie z. B. der Fluoreszenzbildgebung, zum Problem werden kann.
Bei der quantitativen Phasenbildgebung wird ein Puls eines flachen Lichtbogens auf die Zelle geschickt und dann die Phasenverschiebung der Lichtwellen gemessen, nachdem sie die Zelle durchlaufen haben.

Die Computeranalyse rekonstruiert dann ein Bild der wichtigsten Strukturen im Inneren der Zelle.

Ideguchi und seine Mitarbeiter haben bereits andere Methoden zur Verbesserung der quantitativen Phasenmikroskopie entwickelt.
Die quantitative Phasenmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung einzelner Zellen, da sie es den Forschern ermöglicht, detaillierte Messungen vorzunehmen, wie z. B. die Verfolgung der Wachstumsrate einer Zelle anhand der Verschiebung der Lichtwellen. Der quantitative Aspekt der Technik hat jedoch aufgrund der geringen Sättigungskapazität des Bildsensors eine geringe Empfindlichkeit, so dass die Verfolgung von nanoskaligen Partikeln in und um Zellen mit einem herkömmlichen Ansatz nicht möglich ist.

Die neue ADRIFT-QPI-Methode hat die Einschränkung des Dynamikbereichs der quantitativen Phasenbildgebung überwunden.

Bei ADRIFT-QPI macht die Kamera zwei Belichtungen und erzeugt ein endgültiges Bild, das eine siebenmal höhere Empfindlichkeit hat als herkömmliche quantitative Phasenmikroskopie-Bilder.
Die erste Aufnahme wird mit herkömmlicher quantitativer Phasenbildgebung erstellt – ein flaches Lichtblatt wird auf die Probe gepulst und die Phasenverschiebungen des Lichts werden gemessen, nachdem es die Probe durchlaufen hat.

Ein Computer-Bildanalyseprogramm entwickelt ein Bild der Probe basierend auf der ersten Aufnahme und entwirft dann schnell eine modellierte Wellenfront des Lichts, die dieses Bild der Probe widerspiegelt.

Ein separates Bauteil, das so genannte Wavefront Shaping Device, erzeugt dann diese “Lichtskulptur” mit einer höheren Lichtintensität für eine stärkere Beleuchtung und pulsiert sie für eine zweite Belichtung auf die Probe.
Wenn die erste Belichtung ein Bild erzeugte, das die Probe perfekt abbildete, würden die speziell geformten Lichtwellen der zweiten Belichtung in unterschiedlichen Phasen in die Probe eintreten, die Probe durchlaufen und dann als flache Lichtplatte wieder austreten, so dass die Kamera nur ein dunkles Bild sehen würde.
“Das ist das Interessante: Wir löschen sozusagen das Bild der Probe aus.

Wir wollen fast nichts sehen.

Wir löschen die großen Strukturen aus, damit wir die kleineren im Detail sehen können”, erklärt Ideguchi.
In der Realität ist die erste Belichtung unvollkommen, so dass die skulpturierten Lichtwellen mit subtilen Phasenabweichungen auftauchen.
Die zweite Belichtung offenbart winzige Lichtphasenunterschiede, die durch größere Unterschiede in der ersten Belichtung “ausgewaschen” wurden.

Diese verbleibenden winzigen Lichtphasendifferenzen können aufgrund der stärkeren Beleuchtung bei der zweiten Belichtung mit erhöhter Empfindlichkeit gemessen werden.
Eine zusätzliche Computeranalyse rekonstruiert aus den beiden Messergebnissen ein endgültiges Bild der Probe mit einem erweiterten Dynamikbereich.

In Proof-of-Concept-Demonstrationen schätzen die Forscher, dass das ADRIFT-QPI Bilder mit siebenmal höherer Empfindlichkeit erzeugt als die herkömmliche quantitative Phasenbildgebung.
Ideguchi sagt, dass der wahre Vorteil von ADRIFT-QPI in der Fähigkeit liegt, winzige Partikel im Kontext der gesamten lebenden Zelle zu sehen, ohne dass irgendwelche Markierungen oder Färbungen benötigt werden.
“Zum Beispiel könnten kleine Signale von nanoskaligen Partikeln wie Viren oder Partikeln, die sich innerhalb und außerhalb einer Zelle bewegen, erkannt werden, was eine gleichzeitige Beobachtung ihres Verhaltens und des Zustands der Zelle ermöglicht”, so Ideguchi.
Referenz: “Adaptive dynamic range shift (ADRIFT) quantitative phase imaging” von K.

Toda, M.

Tamamitsu und T.

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